단당류 분석은 바이오의약품의 특성분석에 대한ICH Q6B 지침에 명시된 규제 요건입니다. 이 정보는 glycosylation의 유형 (N-linked 또는 O-linked)과 glycosylation 발생 정도를 결정하는 방법으로 약물 개발의 모든 단계에서 사용할 수 있습니다. 또한 제조 공정 중에 QC lot release를 위한 배치 간의 일관성을 입증하는 데 사용할 수도 있습니다.

단당류 분석에 널리 사용되는 방법은 다음과 같습니다.

• 약한 산 가수 분해로 당단백질에서 단당류 방출.
• 2-aminobenzoic acid (2AA)으로 released 단당류의 형광 labeling.
• HPLC / UHPLC column을 이용한 2 AA labeled 단당류의 상대적 정량적 분석

LudgerTag™ Monosaccharide Release and Labelling kit (Cat No. LT-MONO-96)는 당단백질에서 중성 및 아미노 단당류를 떼어내고 2AA로 labeling하는 데 필요한 모든 것을 제공합니다. 키트에는 최대 96개의 당단백질 샘플 (일반적으로 샘플 당 약 50µg의 당단백질)을 처리할 수 있는 시약과 재료가 들어 있습니다. 여기에는 6개의 단당류가 들어있는 quantitative standards (monomix)가 포함되어 있습니다. 당단백질의 단당 성분을 정량적으로 결정하기 위해 Monomix standard로 분석기기를 교정할 수 있습니다. Monomix standard는 five point calibration curve를 사용하는 것이 좋습니다. 자세한 프로토콜은 키트 안내서에 설명되어 있습니다. 

일반적으로 식물이나 곤충에서는 발견되지만 포유류나 효모 발현 벡터에서는 발견되지 않는 단당류인 Xylose도 들어 있어 internal standard로 사용할 수 있습니다 (즉, labelling 전에 각 샘플에 첨가). 이를 통해 샘플 처리 중에 발생할 수 있는 피펫팅/샘플 준비과정의 오류를 보정할 수 있습니다. 또한 positive control로 Ludger BioQuant™ quantitative standards 중의 하나인 purified glycopeptide standard를 권장합니다. 이 quantitative standard (Cat. No. BQ-GPEP-A2G2S2-10U)는 2개의 N-acetylneuraminic acids로 끝나는 complex biantennary N-glycan입니다. 이 standard를 사용하면 glycan release, labeling 그리고 recovery의 효율성을 확인할 수 있으며 단당류 측정의 정확성에 대한 확신을 얻을 수 있습니다.

2AA-labeled monosaccharide standards profiled on a LudgerSep uR2 UHPLC column (Cat No. LS-UR2-2.1x50). Peaks for the following monosaccharides appear within 8 minutes; glucosamine (GlcN), galactosamine (GalN), galactose (Gal), mannose (Man), glucose (Glc), xylose (Xyl) and fucose (Fuc).

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